Catatan Analisis Farmasi #7

[Sumber Gambar: daddydoctrines.com]

Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita, 2006).

Validasi metode analisis penting dilakukan pada industri farmasi untuk menunjukkan bahwa semua metode tetap yang digunakan telah sesuai dengan tujuan penggunaannya dan selalu memberikan hasil yang dapat dipercaya. Pada definisi yang lain di industri farmasi, validasi merupakan cara untuk memastikan bahwa proses pembuatan mampu menghasilkan produk jadi yang memenuhi standar mutu yang ditetapkan secara konsisten. Lagipula, validasi metode analisis diperlukan dalam memenuhi standar CPOB (Cara Pembuatan Obat yang Baik). 

Pada Per KBPOM No. HK.03.1.33.12.12.8195 Tahun 2012 tentang Penerapan Pedoman Cara Pembuatan Obat yang Baik, disebutkan bahwa, "Metode analisis hendaklah divalidasi kecuali metode yang digunakan tersebut terdapat dalam farmakope yang relevan atau rujukan standar lain yang diakui. Meskipun demikian kesesuaian semua metode pengujian yang digunakan hendaklah diverifikasi pada kondisi aktual pengujian dan didokumentasikan. Metode hendaklah divalidasi dengan mempertimbangkan karakteristik yang tercangkup dalam ICH Guidelines tentang validasi metode analisis. Tingkat validasi analisis yang dilaksanakan hendaklah menggambarkan tujuan analisis dan tahapan proses produksi bahan aktif obat. Kualifikasi peralatan analitis yang tepat hendaklah dipertimbangkan sebelum memulai validasi metode analisis. Catatan lengkap hendaklah dibuat untuk tiap modifikasi metode analisis yang tervalidasi. Catatan seperti itu hendaklah mencakup alasan modifikasi dan data yang tepat untuk memverifikasi di mana modifikasi tersebut memberikan hasil yang akurat dan dapat dipercaya sesuai metode yang ditetapkan."

Secara umum validasi metode analisis perlu dilakukan ketika adanya (1) metode baru yang dikembangkan untuk mengatasi masalah analisis tertentu, atau (2) metode yang sudah baku lalu direvisi untuk menyesuaikan perkembangan.

Parameter-parameter dalam validasi metode analisis antara lain:

1. Kecermatan (Accuracy)
2. Keseksamaan (Precision)
3. Selektivitas (Specificity)
4. Linearitas (Linearity)
5. Rentang (Range)
6. Batas kuantitasi (LOQ) dan batas deteksi (LOD)
7. Ketangguhan (Ruggedness)
8. Kekuatan (Robustness)

Kecermatan  (Accuracy) adalah kedekatan hasil yang diperoleh dengan hasil sebenarnya. Kecermatan dinyatakan sebagai hasil perolehan kembali dari analit yang ditambahkan. Akurasi diperoleh dengan membandingkan hasil pengukuran dengan bahan rujukan standar. Selain itu juga dapat ditetapkan menggunakan metode simulasi atau spiked placebo recovery atau metode penambahan bahan baku/standard addition method. ICH merekomendasikan kumpulan data dari 9 kali penetapan kadar dengan 3 konsentrasi yang berbeda (misalnya 3 konsentrasi dengan 3 kali replikasi (triplo)), kemudian data harus dilaporkan sebagai persentase perolehan kembali.

Contoh perhitungannya:
Diperoleh data kurva kalibrasi sebagai berikut:

(klik untuk memperbesar)

Diperoleh data 3 kosentrasi yang berbeda dengan masing-masing tiga kali replikasi sebagai berikut:

Kemudian dengan menggunakan luas puncak yang diperoleh, dihitung konsentrasi yang diperoleh berdasarkan persamaan kurva kalibrasi. Lalu, dari kosentrasi yang diperoleh tersebut, dihitung persentase perolehan kembalinya. Di bawah ini adalah contoh perhitungannya disertai dengan hasil perhitungan seluruh konsentrasinya.

(klik untuk memperbesar)

Seharusnya rata-rata persentase perolehan kembali sediaan obat berada pada rentang 98% sampai dengan 102%.

Keseksamaan (Precision) adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang homogen. Presisi ada 3 macam yaitu (1) keterulangan (repeatibility), (2) presisi antara (intermediate precision), dan (3) ketertiruan (reproducibility). Keterulangan (repeatibility) merupakan kondisi analisis yang sama dan interval waktu yang singkat (within-assay, intra-assay) dengan minimal 9 sampel (3 kosentrasi, masing-masing tripl) atau minimal 6 sampel dengan konsentrasi 100%. Presisi antara (intermediate precision) dilakukan untuk melihat ada atau tidaknya pengaruh perubahan faktor tertentu pada mtode analisis seperti hari, peralatan, dan analisis. Sementara ketertiruan (reproducibility) dilakukan untuk melihat efek inter laboratory (jika analisis dilakukan di laboratorium yang berbeda. Ketertiruan ini wajib dilakukan jika metode analisis tersebut akan dimasukkan ke dalam Farmakope. Presisi dinyatakan dengan menghitung Simpangan Baku Relatif atau Koefisien Variasi.

(klik untuk memperbesar)

Umumnya presisi yang baik untuk bahan obat memiliki KV kurang dari 2%. Namun, untuk bahan tumbuhan biasanya dapat kurang dari 10%, serta untuk cairan biologis kurang dari sama dengan 15 sampai 20%.

Selektivitas (Specificity) adalah kemampuannya yang hanya mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel. Selektivitas seringkali dapat dinyatakan sebagai derajat penyimpangan metode yang dilakukan terhadap sampel yang mengandung bahan yang ditambahkan berupa cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya, dan dibandingkan terhadap hasil analisis sampel yang tidak mengandung bahan lain yang ditambahkan. Selektivitas pada uji identifikasi ditunjukan dengan suatu metode analisis untuk membedakan antara senyawa yang memiliki struktur molekul yang hampir sama. Sementara pada uji kemurnian, selektivitas ditunjukkan oleh daya pisah dua senyawa yang berdekatan. Sebagai contoh, pada kromatografi, selektivitas dapat diukur dengan parameter resolusi (R). Resolusi yang baik apabila R lebih dari 1,5. Jadi, jika lebih dari 1,5 maka metode analisis kromatografi tersebut memiliki selektivitas yang tinggi.

Pada uji selektivitas: (1) apabila cemaran atau hasil urai tersedia maka digunakan bahan baku murni yang ditambahkan cemaran/hasil urainya dengan cara disuntikkan ke kromatografi lalu dilihat dan diukur resolusinya, (2) apabila cemaran atau hasil ura tidak tersedia, maka digunakan stress sampel, jadi sampel bahan baku diperlakukan pada kondisi stress seperti pada pemaparan cahaya, pemanasan, hidrolisis asam/basa, dan oksidasi. Untuk melihat kemurnian puncak, dapat digunakan detektor yang spesifik seperti DAD (Diode Array Detector) atau mass spectrometry.

Linearitas (Linearity) adalah kemampuan metode analisis yang memberikan respon yang secara langsung atau dengan bantuan transformasi matematik yang baik, proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Linieritas dapat ditujukan dengan adanya hubungan yang linier pada parameter, melalui nilai dari koefisien korelasi r pada analisis regresi linier y = a + bx di mana r lebih dari sama dengan 0,9990. Selain itu, Linieritas juga dinyatakan melalui Vxo (koefisien variasi dari fungsi) yang diperoleh dari simpangan baku residual (Sy).

Contoh perhitungan nilai r sama seperti pada kurva kalibrasi sebelumnya, yaitu r = 0,9998. Nilai r ini dapat diperoleh menggunakan kalkulator saintifik. Vxo untuk sediaan farmasi kurang dari sama dengan 2,0%, sementara untuk sediaan biologi, kurang dari sama dengan 5,0%. Contoh perhitungan Vxo dapat dilihat pada bagian LOD dan LOQ. Pengujian linieritas dilakukan minimal pada 5 titik.

Rentang (Range) adalah pernyataan batas terendah dan tertinggi analit yang sudah ditunjukkan dapat ditetapkan dengan kecermatan, keseksamaan, dan linearitas yang dapat diterima. Rentang umumnya merupakan turunan dari penilaian linieritas dan tergantung pada tujuan penggunaan prosedur analisis. Rentang minimal yang ditentukan perlu dipertimbangkan pada masing-masing prosedur: (1) untuk prosedur penetapan kadar zat obat atau produk obat, umumnya 80-120% dari konsentrasi uji, (2) untuk keseragaman kandungan, cakupan minimum 70-130% dari konsentrasi uji kecuali disebutkan rentang lebih lebar tergantung bentuk sediaan, (3) untuk uji disolusi, kurang lebih 20% di atas rentang yang ditentukan, sementara (4) untuk penetapan cemaran, tingkat cemaran yang dilaporkan sampai 120% dari spesifikasi, cemaran yang diketahui poten atau menghasilkan toksin atau efek farmakologis yang tidak diharapkan, LOD harus setara pada tingkat/kadar berapa cemaran harus dikendalikan, dan (5) untuk penetapan kadar serta uji kemurnian yang dilakukan sebagai satu pengujian dengan standar 100% yang digunakan, linieritas harus mencakup rentang dari kadar cemaran yang dilaporkan sampai 120% dari spesifikasi penetapan kadar.

Batas deteksi (LOD) adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blangko. Batas kuantitasi (LOQ) merupakan parameter pada analisis reknik dan diartikan sebagai kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria akurasi dan presisi.  

Contoh perhitungannya adalah sebagai berikut:

Ketangguhan metode (Ruggedness) adalah derajat ketertiruan hasil uji yang diperoleh dari analisis sampel yang sama dalam berbagai kondisi uji normal, seperti laboratorium, analisis, instrumen, bahan pereaksi, suhu, hari yang berbeda, dan lainnya. Ketangguhan biasanya dinyatakan sebagai tidak adanya pengaruh perbedaan operasi atau lingkungan kerja pada hasil uji. Ketangguhan metode merupakan ukuran ketertiruan pada kondisi operasi normal antar lab dan antar analis. Cara penentuannya yaitu dengan menganalisis sampel yang homogen dalam laboratorium yang berbeda menggunakan operasi yang berbeda dan lingkungan yang berbeda tetapi menggunakan prosedur dan parameter uji yang sama. Derajat ketertiruan hasil kemudian ditentukan sebagai fungsi dari variabel penentuan. Ketertiruan dapat dibandingkan terhadap keseksamaan penentuan di bawah kondisi normal untuk mendapatkan ukuran ketangguhan metode. Selanjutnya, derajat ketertiruan hasil uji ditentukan sebagai fungsi dari variabel-variabel penentuan. Perhitungan dapat dilakukan secara statistik ANOVA.

Kekuatan (Robustness) adalah kemampuan metode analisis untuk tidak terpengaruh oleh perubahan kecil, seperti variasi yang sengaja dibuat dalam parameter metode analisis. Serta dapat memberikan indikasi kehandalannya dalam penggunaan secara normal. Stabilitas dari nilai yang diamati dapat diuji dengan mengubah beberapa kondisi analisis seperti pH larutan, suhu reaksi, waktu reaksi atau penambahan reagen. Ketika nilai yang diamati tidak stabil, prosedur analisis harus diperbaiki. Untuk memvalidasi kekuatan suatu metode perlu dibuat perubahan metodologi yang kecil dan terus menerus serta mengevaluasi respon analitik dan efek pada presisi dan akurasi.

Dalam kasus kromatografi cair, contoh variasinya dapat berupa pengaruh variasi pH dalam fase gerak, pengaruh variasi komposisi fase gerak, kolom yang berbeda, suhu, atau laju alir. Sementara dalam kasus kromatografi gas, contoh variasinya dapat berupa kolom yang berbeda, suhu, dan laju alir. 

Uji kesesuaian sistem dilakukan untuk memastikan suatu sistem berjalan dengan baik dan benar serta memastikan bahwa sistem dan prosedur yang digunakan harus mampu memberikan data yang dapat diterima. Uji kesesuaian sistem didasarkan pada konsep bahwa elektronik, peralatan, zat uji, dan kondisi operasional analitik merupakan suatu sistem analitik tunggal yang dapat diuji fungsinya secara keseluruhan. Data dapat dikumpulkan dari penyuntikkan berulang larutan standar dan uji sebanyak 6 kali.

Demikian yang dapat saya sampaikan, mohon maaf apabila terdapat kesalahan. Semoga bermanfaat dan terima kasih sudah berkunjung :D