Catatan Analisis Farmasi #4

[Sumber Gambar: csi.edu]

Catatan yang ini membahas mengenai tugas kedua yang dikerjakan oleh kelompok kedua, yaitu spesifikasi Sulfadoksin terkait jarak lebur dan kemurnian kromatografi, serta ditambah 3 bahan baku lain yang mempunyai spesifikasi sama. Apa yang saya tulis di sini bersumber dari apa yang dijelaskan kelompok ini di kelas, slide presentasi, makalahnya, FI IV, serta penjelasan atau komentar dari dosen yang saya dengar di kelas. 

Jarak lebur didefinisikan sebagai rentang temperatur atau suhu pada saat bentuk padat mulai melebur hingga keseluruhan sampel melebur sempurna. Sulfadoksin memiliki struktur senyawa sebagai berikut:

Jarak lebur Sulfadoxin antara 197 dan 200 derajat. Berdasarkan FI IV, Sulfadoksin ditentukan jarak leburnya menggunakan metode III, yaitu:

1. Gerus Sulfadoksin menjadi serbuk sangat halus.
2. Masukkan serbuk Sulfadoksin yang telah halus ke dalam pipa kapiler kaca yang salah satu ujungnya tertutup hingga membentuk kolom di dasar tabung dengan tinggi 2,5 mm hingga 3,5 mm setelah diisi semampat mungkin dengan cara mengetukkan secukupnya pada permukaan padat.
3. Panaskan tangas hingga suhu 10 derajat di bawah suhu lebur yang diperkirakan (197 derajat). Naikkan suhu dengan kecepatan 1 derajat per menit. 
4. Masukkan kapiler, angkat termometer dan secepatnya tempelkan tabung kapiler pada termometer dan atur hingga tinggi bahan dalam kapiler setinggi pencadang raksa. Tempatkan kembali termometer dan lanjutkan pemanasan dengan pengadukkan tetap secukupnya. Bila suhu mencapai 5 derajat selsius di bawah suhu terendah yang diperkirakan, lanjutkan pemanasan hingga melebur sempurna.
5. Catat jarak lebur. 

Pipa kapiler yang digunakan adalah pipa kapiler yang berdinding tipis (0,2 mm sampai 0,3 mm) dan salah satu ujungnya harus ditutup agar dapat diisi. Untuk dapat menutup salah satu ujungnya, dapat dilakukan dengan membakar salah satu ujungnya pada pembakar bunsen sambil memutar-mutar pipa kapiler hingga ujungnya tertutup sempurna. Kemudian untuk memasukkan serbuk sampel ke dalam pipa kapiler dilakukan dengan menekan perlahan ujung pipa yang terbuka ke sampel dari arah atas lalu dipadatkan dengan cara mengetuk pipa perlahan ke permukaan padat. Jika sampel belum memenuhi pipa kapiler hingga 2,5 sampai 3 mm, sisa sampel dimasukkan dengan menggunakan koin dengan tepi bergerigi atau cara lain yang lebih efektif.

Farmakope Indonesia mencantumkan alat yang digunakan untuk penetapan jarak lebur terdiri dari wadah gelas untuk tangas cairan transparan, alat pengaduk yang sesuai, termometer yang akurat dan sumber panas yang terkendali. Seperangkat alat tersebut lebih dikenal dengan istilah Mel-Temp. Mel-Temp dilengkapi dengan lensa untuk melihat sampel yang beraada pada pipa kapiler agar dapat memastikan sampel mulai melebur dan seluruh sampel melebur sermpurna. Jarak dari mata ke lensa adalah 15 cm.

Sebelum dibahas lebih jauh, saya ingin menyalin apa yang terdapat pada Farmakope Indonesia mengenai Penetapan Jarak Lebur atau Suhu Lebur <1021> pada halaman 1032. 

"Dalam Farmakope, jarak lebur atau suhu lebur zat padat didefinisikan sebagai rentang suhu atau suhu pada saat zat padat menyatu dan melebur sempurna, kecuali didefinisikan untuk metode IV dan V di bawah ini. Setiap alat atau metode yang mampu dan memiliki ketelitian yang setara dapat digunakan. Ketelitian harus sering diperiksa dengan menggunakan salah satu atau lebih dari enam Baku Pembanding Suhu Lebur BPFI, lebih baik digunakan satu baku yang melebur paling dekat dengan suhu lebur senyawa yang ditetapkan seperti yang tertera pada baku pembanding <11>.

Lima prosedur untuk penetapan jarak lebur atau suhu lebur yang diberikan berikut ini bervariasi tergantung pada keadaan sifat dasar senyawa yang diuji. Jika tidak dinyatakan dalam monografi, gunakan Metode III.

Prosedur yang dikenal sebagai penetapan suhu lebur campuran, untuk jarak lebur suatu zat padat yang diuji dibandingkan dengan campuran bagian yang sama dari zat padat tersebut dan senyawa aslinya, misal Baku Pembanding FI yang sesuai, dapat digunakan utnuk konfirmasi uji identifikasi. Kesesuaian dari hasil pengamatan contoh aslid an campuran menunjukkan identitas kimia yang jelas dan dapat dipercaya.

Alat. Contoh alat penetapan jarak lebur yang sesuai terdiri dari wadah gelas untuk cairan transparan, alat pengaduk yang sesuai, termometer yang akurat (seperti yang tertera pada Termometer <31>) dan suber panas yang terkendali. Cairan dalam tangas dipilih dengan melihat suhu yang dikehendaki, tetapi umumnya digunakan parafin cair dan silikon cair yang baik untuk rentang suhu yang lebih tinggi. Cairan dalam tangas mempunyai kedalaman yang cukup sehingga termometerdapat tercelup dengan pencadang raksa tetap berada lebih kurang 2 cm di atas dasar tangas. Panad didapat dari api bebas atau listrik. Pipa kapiler berukuran panjang lebih kurang 10 cm dan diameter dalam 0,8 mm sampai 1,2 mm dengan ketebalan dinding 0,2 mm sampai 0,3 mm. 

Metode I. Gerus senyawa yang diuji menjadi serbuk halus, dan kecuali dinyatakan lain, jika mengandung air hidrat ubah menjadi anhidrat dengan pengeringan pada suhu yang tertera pada monografi, atau jika senyawa tidak mengandung air hidrat, keringkat di atas bahan pengering yang sesuai selama tidak kurang dari 16 jam.

Isi pipa kapiler kaca yang salah satu ujungnya tertutup, dengan serbuk kering secukupnya hingga membentuk kolom di dasar tabung dengan tinggi 2,5 m hingga 3,5 mm setelah diisi semampat mungkin dengan cara mengetukkan secukupnya pada permukaan padat.

Panaskan tangas hingga suhu lebur 30 derajat di bawah suhu lebur yang diperkirakan. Angkat termometer dan secepatnya tempelkan tabung kapiler pada termometer dengan membasahi keduanya dengan tetesan cairan dari tangas atau sebaliknya, dan atur hingga tinggi bahan dalam kapiler setinggi pencadang ranksa. Tempatkan kembali termometer, dan lanjutnkan pemasanan dengan pengadukkan tetap secukupnya, hingga menyebabkan suhu naik lebih kurang 3 derajat per menit. Pada saat suhu lebih kurang 3 derajat di bawah dari batas bawah jarak lebur yang diperkirakan, kurangi pemanasan sehingga suhu naik lebih kurang 1 derajat hingga 2 derajat per menit. Lanjutkan pemanasan sampai melebur sempurna.

Suhu pada saat kolom uji yang diamati terlepas sempurna dari dinding kapiler didefinisikan sebagai permulaan melebur dan suhu pada saat zat uji mencair seluruhnya didefinisikan sebagai akhir peleburan atau "suhu lebur". Kedua suhu tersebut berada dalam batas jarak lebur.

Metode II. Letakkan zat uji dalam wadah tertutup, dinginkan hingga suhu 10 derajat atau lebih rendah selama tidak kurang dari 2 jam. Tanpa diserbutkan sebelumnya, isi bahan yang sudah dingin ke dalam pipa kapiler seperti pada metode I, kemudian segera letakkan kapiler yang telah diisi ke dalam desikator hampa, keringkan pada tekanan tidak lebih dari 20 mmHg selama 3 jam. Segera keluarkan dari desikator, lebur tutup ujung terbuka kapiler dan sesegera mungkin lanjutkan penetapan jarak lebur seprti berikut: Panaskan tangas hingga suhu 10 derajat +- 1 derajat di bawah rentang lebur yang diperkirakan. Kemudian masukkan kapiler yang berisi zat uji, dan panaskan dengan kenaikkan suhu 3 derajat +- 0,5 derajat per menit hingga melebur sempurna. Catat jarak lebur seperti tertera pada metode I.

Jika ukuran partikel terlalu besar untuk kapiler, dinginkan terlebih dahulu zat uji seperti di atas, gerus patikel hati-hati dengan tekanan rendah hingga sesuai dengan kapiler dan segera isikan ke dalam kapiler.

Metode III. Siapkan zat uji dan masukkan ke dalam kapiler seperti pada metode I. Panaskan tangas hingga suhu lebih kurang 10 derajat di bawah suhu lebur yang diperkirakan, dan naikkan suhu dengan kecepatan 1 derajat +- 0,5 derajat per menit. Masukkan kapiler seperti metode I, bila suhu mencapai 5 derajat di bawah suhu terenah yang diperkirakan, lanjutkan pemanasan hinga melebur sempurna. Catat

jarak lebur seperti pada metode I.

Metode IV. Lebur hati-hati senyawa yang akan ditetapkan pada suhu serendah mungkin, masukkan di dalam pipa kapiler, yang kedua ujungnya terbuka, hingga kedalaman 10 mm. Dinginkan kapiler yang telah berisi zat uji pada suhu 10 derajat atau lebih rendah selama 24 jam, atau tempelkan pada es selama tidak kurang dari 2 jam. Kemudian tempelkan tabung pada termometer dengan cara yang sesuai, atur dalam tangas air sehingga ujung atas dari zat uji 10 mm di bawah permukaan air dan dipanaskan seperti pada metode I, kecuali sampai 5 derajat dari suhu lebur yang diperkirakan, atur kenaikan suhu 0,5 derajat sampai 1,0 derajat per menit. Suhu pada saat senyawa yang diamati dalam pipa kapiler menaik adalah suhu lebur.

Metode V. Lebur perlahan-lahan sejumlah zat uji sambil diaduk, hingga mencapai suhu 90 derajat hingga 92 derajat. Pindahkan sumber panas dan biarkan leburan senyawa mendingin hingga 8 derajat sampai 10 derajat di atas suhu lebur yang diperkirakan. Dinginkan pencadang raksa (seperti yang tertera pada Termometer <31> ) hingga suhu 5 derajat, bersihkan hingga kering, dan sewaktu masih dingin celupkan ke dalam leburan senyawa hingga lebih kurang separo bagian bawah pencadang terendam. Ambil secepatnya, dan tahan secara vertikal dari panas hingga permukaan zat uji menjadi buram, kemudian celupkan selama 5 menit ke dalam tangas air pada suhu tidak lebih dari 16 derajat.

Letakkan erat termometer dalam tabung reaksi sehingga ujung terendam 15 mm di atas dasar tabung reaksi. Celupkan tabung reaksi dalam tangas air yang telah diatur pada suhu lebih kurang 16 derajat, dan naikkan suhu tangas air 2 derajat per menit hingga suhu 30 derajat, kemudian turunkan hingga suhu 1 derajat per menit, dan catat suhu pada saat tetesan pertamasenyawa meleleh lepas dari termometer. Ulangi penetapan 2 kali menggunakan senyawa yang baru dilelehkan. Jika variasi tiga kali penetapan kurang dari 1 derajat, gunakan hasil rata-rata ketiga penetapan tersebut sebagai suhu lebur. Jika variasi lebih besar dari 1 derajat, lakukan dua penetapan tambahan dan gunakan hasil rata-rata dari lima penetapan sebagai suhu lebur."

Tiga bahan baku lain yang memiliki spesifikasi sama, yaitu jarak lebur, yang dipilih adalah Amitriptilin Hidroklorida dengan jarak lebur antara 195 derajat dan 199 derajat,  Ketokonazol (148-152 derajat), dan Prokain Hidroklorida (153-158 derajat).

Penentuan jarak lebur ketiga bahan baku tersebut sesuai dengan metode III, sehingga prosedurnya sama seperti Sulfadoksin.

Sulfadoksin dan Amitriptilin Hidroklorida memiliki BM yang hampir sama, dan memilki struktur bangun yang simetris sehingga kedua senyawa tesrsebut memiliki jarak lebur yang hampir sama. Sementara Prokain HCl memiliki BM yang lebih rendah dari Sulfadoksin sehingga jarak leburnya pun juga lebih rendah. Berbeda dengan Prokain HCl, Ketokonazol memiliki BM yang besar, namun jarak leburnya rendah. Hal ini dipengaruhi oleh struktur bangun Ketokonazol yang atom O berikatan dengan atom C yang mengikat gugus piperazin adalah ikatan lemah yang mudah terlepas oleh panas. Tidak seperti Sulfadoksin dan Amitriptilin HCl yang memiliki banyak ikatan hidrogen.

Kemudian mengenai kemurnian kromatografi. Uji kemurinian dilakukan untuk membuktikan bahwa bahan yang diuji bebas dari senyawa asing dan cemaran pada batas tertentu. Pengujian terhadap adanya senyawa asing dan cemaran dimaksudkan untuk membatasi senyawa, sampai pada jumlah yang tidak mempengaruhi bahan utama pada kondisi penggunaan biasa. Pengukuran kemurnian dapat dengan beberapa cara, salah satunya dengan kromatografi baik KLT, KCKT, maupun KG.

Uji kemurnian menggunakan KLT pada Sulfadoksin, hampir sama prosedurnya seperti uji cemaran umum. Hanya saja larutan baku yang diperlukan hanya satu kadar saja yaitu 0,1 mg per ml, sementara larutan uji dibuat pada kadar 20 mg per ml. Bahan baku Sulfadoksin dianggap murni apabila bercak lain selain bercak utama yang diperoleh dari larutan uji tidak lebih besar dan intensif dari bercak larutan baku.

Untuk uji kemurnian kromatografi menggunakan KLT untuk ketiga bahan baku lainnya prinsipnya sama.

Selanjutnya adalah komentar atau penjelasan dari dosen.

Jadi, jika tidak disebutkan pada monografi, suatu bahan baku, penentuan jarak leburnya menggunakan metode III. Untuk memverifikasi, tidak boleh menggunakan metode semau kita, karena tiap senyawa punya karakter masing-masing. Kalau tidak sesuai metode yang digunakannya, maka hasilnya dapat menyimpang, sehingga dapat terjadi pengambilan keputusan yang salah.

"Metode III itu untuk senyawa yang seperti apa?" tanya Pak Hayun. Untuk zat padat. Metode III itu merupakan metode yang paling mudah, Kalau ada bahan baku yang kasar, ya digerus terlebih dahulu. "Senyawa padat yang seperti apa? Yang suhunya di atas 105 derjat, di atas suhu air menguap."

Pipa kapiler itu ada 2 macam, ada yang ujung keduanya terbuka, ada yang salah satunya tertutup. Tapi yang dijual kebanyakan yang pipa kapiler yang kedua ujungnya terbuka. Kalau memang mengharuskan salah satunya tertutup, maka dilakukan penutupan terlebih dahulu, sebagaimana caranya telah dijelaskan sebelumnya.

Alat uji penetapan jarak lebur, pemanasnya ada 2 macam, yaitu yang pemanas balok dan pemanas cairan. Yang paling banyak dijual adalah yang pemanas balok. Sebenarnya kalau yang cairan bisa dibuat sendiri, asal ada termometer, gelas beaker, dan kaca pembesar.

"Kapan digunakan pemanas balok?" Kalau pipa kapiler yang digunkana adalah yang salah satu ujungnya tertutup. Kalau ujung keduanya terbuka, jangan gunakan pemanas balok, karena nanti cairan leburannya akan jatuh dan mengotori baloknya. Jadi lebih baik menggunakan pemanas cairan.

Untuk bahan baku yang harus dikeringkan dahulu, hal itu dilakukan karena bahan bakunya atau senyawanya bersifat higroskopis. Jadi, metode penetapan kadarnya menggunakan metode I, yang ada tahapan pengeringan terlebih dahulu. Jadi bedanya metode I dan metode III itu ada pada penyiapan sampelnya.

Umumnya pada penentuan jarak lebur, sampel senyawa akan terdestruksi, jadi pada pipa kapiler, setelah selesai peleburan, ujung pipa kapilernya akan berwarna hitam, warna dari senyawa yang telah rusak.

Ada juga senyawa yang jarak leburnya rendah sehingga ketika digerus bisa meleleh. Untuk yang seperti ini tidak bisa menggunakan metode I, II, atau III, seperti Oleum Cacao, metode yang sesuai adalah yang metode IV/V. Bedanya pada metode IV, pengamatan dilakukan saat suhu kapiler menaik, sementara metode V saat mulai menetes.

Metode II itu digunakan untuk penentuan jarak lebur pada bahan baku padat, yang pada suhu kamar digerus dapat meleleh. Jadi, penggerusan dilakukan pada suhu di bawah jarak leburnya. Misalnya dalam ice bath atau lumpang yang didinginkan. Jadi tidak meleleh dan bisa menjadi serbuk, lalu mudah dimasukkan ke dalam pipa kapiler yang ujung satunya tertutup.

Mengenai penggunaan kromatografi, hampir sama dengan uji cemaran umum pakai KLT. Lalu bedanya apa uji cemaran umum dengan kemurnian kromatografi dengan KLT? Uji cemaran, kadar sampel bisa berbeda-beda antara yang satu dengan yang lain, tergantung dari karakteristik penampakkannya, ada yang dengan kadar sedikit saja sudah kelihatan, ada yang membutuhkan kadar dalam jumlah banyak baru kelihatan. Beda baku pembandingnya juga, ada yang butuh 4 baku pembanding, ada yang satu saja cukup. Sistem kromatografinya pun juga berbeda. (Tetapi terkait dengan hal ini, saya masih bingung, apa benar yang saya catat mengenai penjelasan perbedaan uji cemaran dan kemurnian kromatografi? Atau penjelasannya terbalik, berhubung saya ragu dengan catatan saya, jadi saya mohon maaf apabila salah. Silakan cari dari sumber yang lain untuk memperoleh penjelasan yang benar).

Penggunaan kromatografi sangat penting. Apabila dalam spesifikasi bahan bakunya ada pengujian dengan KLT ini, maka pengujian ini menjadi prioritas. Untuk verifikasi, mutlak dilakukan. Berhubung suatu senyawa memiliki potensi besar terurai akibat berbagai macam faktor.

Kalau dilihat dari struktur, tidak sestabil senyawa pada umumnya. Karena senyawa golongan sulfonamida, ester, dan sebagainya mudah mengalami degradasi. Jadi, perlu konfirmasi beanr atau tidaknya terdapat degradasi.

Demikian yang dapat saya sampaikan. Terima kasih untuk kelompok 2 yang terdiri dari Azizah, Dianah, Riah, Mel, Lia, dan Era yang telah mempresentasikan tugas kedua ini dengan baik. Mohon maaf apabila terdapat kesalahan. Semoga bermanfaat dan terima kasih sudah berkunjung :D