Catatan Analisis Farmasi #3

[Sumber Gambar: nadjeeb.wordpress.com]

Pada catatan ini, akan dibahas tugas yang diberikan oleh dosen. Tugas pertama mengenai spesifikasi dari Piridostigmin Bromida terkait dengan identifikasi dan uji cemaran umumnya. Ditambah tugas lainnya yaitu mencari 3 bahan baku lain yang memiliki spesifikasi yang sesuai. Yang mempresentasikan tugas ini adalah kelompok 1, saya termasuk ke dalam kelompok 1.

Piridostigmin Bromida.

Piridostigmin bromida memiliki aksi sebagai inhibitor kolinesterase yang digunakan untuk meningkatkan kekuatan otot pada pasien dengan penyakit otot tertentu (miastenia gravis). Zat ini bekerja dengan mencegah pemecahan asetilkolin dalam tubuh. Asetilkolin ini dibutuhkan dalam menjalankan fungsi normal otot. 

Berdasarkan Farmakope Indonesia Edisi V, identifikasinya terdiri dari:

1. Spektrum serapan inframerah zat yang telah dikeringkan dan didispersikan dalam kalium bromida P menunjukkan maksimum hanya pada bilangan gelombang yang sama seperti pada Piridostigmin Bromida BPFI.
2. Spektrum serapan ultraviolet larutan (35 mikrogram per ml) dalam asam klorida 0,1 N menunjukkan maksimum dan minimum pada panjang gelombang yang sama seperti pada Piridostigmin Bromida BPFI; serapan jenis masing-masing, dihitung terhadap zat yang telah dikeringkan pada panjang gelombang serapan maksimum lebih kurang 269 nm berbeda tidak lebih dari 3,0%.
3. Masukkan lebih kurang 100 mg zat ke dalam tabung reaksi, tambahkan 0,6 ml natrium hidroksida 1 N: terjadi warna jingga. Panaskan: warna berubah menjadi kuning dan uap larutan membirukan kertas lakmus merah P.
4. Larutan (1 dalam 50) menunjukkan reaksi Bromida cara A dan B seperti tertera pada Uji Identifikasi Umum <291>.

Mengenai identifikasi berdasarkan spektrum inframerah, di bawah ini adalah spektrum inframerahnya,

 Di bawah ini adalah spektrum UV Piridostigmin Bromida.

Sebelumnya dijelaskan bahwa larutan menunjukkan reaksi Bromida cara A dan B, yaitu: 

A) Tambahkan klor  LP tetes demi tetes terjadi brom bebas yang larut dalam kloroform P pada pengocokan menghasilkan lapiran kloroform merah hingga coklat kemerahan.

B) Tambahkan AgNO3 LP membentuk endapan putih kekuningkan yang tidak larut dalam HNO3 P dan sedikit larut dalam NH4OH 6 N.

Uji cemaran umum yang tertera pada masing-masing monografi digunakan untuk menilai profil cemaran suatu bahan. Cemaran didefinisikan sebagai bahan yang ada dalam senyawa obat/atau sediaan obat dalam jumlah tertentu yang memiliki aktivitas biologis yang tidak diinginkan. Cemaran ini dapat timbul akibat sintesis, proses pembuatan sediaan, atau peruraian bahan. Dalam beberapa kasus, cemaran yang berisiko terhadap kesehatan dapat diidentifikasi. Dalam hal ini, masing-masing cemaran tidak diidentifikasi, uji terpisah mungkin diperlukan untuk memastikan bahwa cemaran yang diidentifikasi telah memenuhi persyaratan batas seperti yang tertera dalam definisi cemran umum. Pemilihan uji dan penetapan kadar memungkinkan untuk menetapkan jumlah cemaran yang dapat diterima pada suatu bahan yang digunakan (Departemen Kesehatan RI, 2014). 

Jika pada monografi tertera batas komponen tertentu dan/atau cemaran atau produk terurai yang dapat diidentifikasi, cemaran umum tidak termasuk dalam perhitungan total cemaran kecuali dinyatakan lain dalam monografi. Komponen yang ada bersama-sama dalam bahan didefinisikan sebagai bahan tertentu dari sediaan oabt yang tidak dianggap sebagai cemaran dalam konteks farmakope. Contoh komponen yang ada bersama-sama dalam pembahasan ini adalah campuran isomer geometrik dan optik (rasemat) dan antibiotik. Komponen lain yang dianggap toksik karena efek biologis tertentu yang tidak diinginkan tidak disebut sebagai komponen yang ada bersama-sama dengan bahan (Departemen Kesehatan RI, 2014).

Pada monografi, uji cemaran Piridostigmin Bromida menggunakan penjerap berupa lempeng selulosa dengan indikator fluoresen, larutan uji dilarutkan dengan pelarut metanol P, larutan baku juga dilarutkan dengan pelarut metanol P, fase gerak berupa campuran metanol P-air (1:1) dan penampak bercak  no. 1 yaitu cahaya ultraviolet pada 254 nm dan 366 nm. Untuk informasi saja, dalam hal ini ada  22 penampak bercak pada bagian Lampiran, tiap zat berbeda penampak bercaknya sesuai dengan yang tertera pada monografi, atau bisa juga di luar 22 penampang bercak tersebut, yaitu ditulis secara khusus penampang bercaknya di monografi (Departemen Kesehatan RI, 2014). 

Metode uji cemaran umum Piridostigmin Bromida terdiri dari beberapa tahapan:

1. Perhitungan persentase jumlah cemaran umum ditetapkan dengan metode relatif yaitu dengan membandingkannya dengan baku pembanding Piridostigmin Bromida BPFI.
2. Uji cemaran umum menggunakan teknik kromatografi lapis tipis.
3. Larutan uji dibuat saksama dalam pelarut metanol P hingga diperoleh +/- 10 mg per ml.
4. Larutan baku dibuat saksama yaitu Piridostigmin Bromida BPFI dalam pelarut metanol P hingga kadar 0,01; 0,05; 0,1; dan 0,2 mg per ml.
5. Lakukan KLT menggunakan lempeng selulosa dengan indikator fluoresen setebal 0,25 mm dan fase gerak metanol P-air (1:1).
6. Totolkan secara terpisah sejumlah volume yang sama +/- 20 mikroliter Larutan uji dan larutan baku, gunakan aliran nitrogen P untuk mengeringkan bercak. 
7. Masukkan lempeng ke dalam bejana kromatografi yang telah dijenuhkan dengan fase gerak hingga merambat +/- tiga per empat tinggi lempeng.
8. Angkat lempeng, keringkan di udara.
9. Amati lempeng menggunakan cahaya ultra violet pada 254 nm dan 366 nm.
10. Tentukan intensitas relatif bercak lain selain bercak utama Larutan uji dengan membandingkannya terhadap kromatogram larutan baku.

Pemilihan pelarut yang digunakan dalam larutan uji dan baku serta fase gerak didasarkan atas sifat Piridostigmin Bromida yang bersifat polar. Senyawa ini polar karena adanya ikatan dengan gugus halida berupa ion Bromida. Pada KLT, zat penjerap dapat berbagai macam (silika gel, tanah diatom, atau serbuk selulosa) tergantung sifat dari senyawa uji (Harmita, 2006). Berhubung senyawa uji bersifat polar, maka zat penjerap yang ditetapkan pada monografi berupa lempeng selulosa yang bersifat nonpolar. Selain itu penjerap yang digunakan juga disertai dengan adanya indikator fluoresen. Indikator fluoresen ditambahkan karena sifatnya yang dapat menyerap cahaya ultraviolet sehingga dapat membantu dalam penampakkan bercak (Departemen Kesehatan RI, 2014).

Uji cemaran umum ini menggunakan teknik KLT. Teknik KLT sangat bermanfaat untuk analisis obat dan bahan lain dalam laboratorium karena hanya memerlukan peralatan sederhana, waktu cukup singkat (15-60 menit), jumlah zat yang diperiksa cukup kecil, tidak diperlukan ruangan yang besar, dan teknis pengerjaannya sederhana (Harmita, 2006). Seperti pada senyawa lainnya, persyaratan jumlah cemaran umum pada Piridostigmin bromida tidak lebih dari 2,0%.

Perhitungan persentase jumlah cemaran umum dapat dilakukan dengan menentukan intensitas relatif bercak lain selain bercak utama Larutan uji dengan membandingkan terhadap kromatogram Larutan baku. Setelah dilakukan perhitungan persentase jumlah cemaran, dapat disimpulkan bahwa bahan baku Piridostigmin Bromida yang diuji memenuhi persyaratan atau tidak.

Tiga bahan baku lain yang memiliki spesifikasi identifikasi dan cemaran umum antara lain Noskapin, Antipirin, dan Apomorfin Hidroklorida. 

Noskapin diidentifikasi juga dengan membandingkan spektrum IR dan UV-nya terhadap baku pembanding. Identifikasi lain yaitu dengan menggunakan 100 mg zat dalam cawan porselen kecil, ditambahkan beberapa tetes asam sulfat P, diaduk, maka akan terjadi larutan berwarna kuning kehijauan dan pada penghangatan menjadi merah kemudian menjadi ungu. Sementara uji cemaran umum Noskapin, menggunakan metode KLT, lempengnya silica gel, larutan baku dan ujinya menggunakan pelarut kloroform P, fase geraknya campuran etil asetat P-eter (80:20), dan penampak bercaknya nomor 17. Penampak bercak no. 17 yaitu dengan meletakkan lempeng selama 10 menit dalam bejana tertutup yang telah dijenuhkan dengan uap iodium dan pada dasar bejana terdapat hablur iodium P. Pengenceran larutan baku yang dibuat yaitu 0,01; 0,05; 0,1; dam 0,2 mg per ml. Rf bercak utama larutan uji sesuai dengan Rf larutan baku. Tidak ada becak lain selain bercak utama yang lebih besar dari batas yang diperbolehkan yaitu 1%. 

Antipirin juga diidentifikasi dengan membandingkan spektrum IR dan UV-nya terhadap baku pembanding. Ditambah dengan identifikasi lain yaitu pada larutan ditambahkan asam tanat LP, maka akan terbentuk endapan putih. Sementara pada uji cemarannya, digunakan metode KLT, lempeng silica gel, larutan baku dan uji menggunakan pelarut kloroform P, fase gerak berupa campuran kloroform P-aseton butil alkohol P-asam format P (60:15:15:15), penampak bercak nomor 1.

Apomorfin Hidroklorida, identifikasinya membandingkan spektrum IR terhadap baku pembanding. Identifikasi lain yaitu larutan zat dalam asam nitrat P, terjadi warna ungu gelap. Sementara uji cemarannya, menggunakan metode KLT, lempeng silica gel, larutan baku dan larutan uji menggunakan pelarut metanol P, fase gerak berupa campuran 1-butanol p-air-asam format (7:2:1), penampak bercak dibuat dengan campuran segar besi (III) klorida P 10%-kalium heksasianoferat (III) P 5% (2:1). Persyaratan tidak ada bercak lain selain bercak utama yang lebih besar dari batas yang diperbolehkan yaitu 2%. 

Selanjutnya, mendapat beberapa tambahan penjelasan, evaluasi, dan komentar dari dosen.

Pada bagian mutu di industri farmasi, meskipun bahan baku telah diterima, harus ada CoA-nya. Kita tidak boleh percaya begitu saja terhadap CoA yang diterima, kita harus melakukan verifikasi CoA. Namun, tidak perlu seluruh parameter diuji. Parameter-parameter khusus saja yang perlu diuji, misalnya identifikasi, kadar, dan lainnya. Pada penetapan kadar perlu diperhatikan untuk zat yang bersifat hidgroskopis. Penetapan kadar tergantung monografi, biasanya diukur setelah dikeringkan. Seandainya diukur tanpa pengeringan, bisa menjadi persoalan seperti tidak memenuhi persyaratan. Jadi, untuk zat yang seperti ini, susut pengeringan penting untuk dilakukan,  

Tidak harus selalu semua parameter harus diuji ketika menerima bahan awal dari supplier. Pemeriksaan semua parameter itu hanya ketika dalam rangka tindakan audit pemasok. Kalau sudah oke, selama tiga kali berturut-turut sesuai, maka kita bisa mengurangi sedikit demi sedikit parameter yang diujinya. Misalnya seperti uji cemaran umum, dilakukan pada saat pertama kali saja, untuk berikutnya kalau sudah percaya, tidak perlu dilakukan kembali.

Tetapi soal identifikasi dan penetapan kadar harus selalu diverifikasi. Identifikasi tidak cukup dengan satu jenis pengujian. Misalnya hanya dengan spektrum IR saja. IR saja tidak cukup, jadi perlu ditambah uji-uji lain untuk menyatakan bahwa bahan yang diterima benar adalah senyawa itu. 

Menarik untuk Piridostigmin Bromida, berbeda dengan morfin yang padahal 1 golongan alkaloid juga. Morfin cukup dengan menunjukkan maksimum dan mininum dari panjang gelombangnya saja. Tetapi untuk Piridostigmin Bromida, juga termasuk senyawa lain yang mengandung Bromida, harus ditentukan serapan jenis juga. Misalnya hanya mengukur panjang gelombang maksimum dan minimum, uji kualitatif saja cukup, tidak perlu ditimbang. Tapi kalau tidak hanya itu, pengukuran serapan jenis, perlu ditimbang dengan saksama, secara kuantitatif. 

Serapan jenis disimbolkan dengan A (1%, 1 cm) merupakan serapan dari larutan 1% zat terlarut dalam sel dengan ketebalan 1 cm. Harga serapan jenis pada panjang gelombang tertentu dalam suatu pelarut merupakan sifat dari zat terlarut. Sementara serapan molar disebut juga dengan koefisien atenuasi molar atau koefisien ekstinsi molar, merupakan pengukuran seberapa kuat spesies kimia melemahkan cahaya pada panjang gelombang tertentu. Ini merupakan sifat intrinsik dari suatu spesies. satuannya adalah meter persegi per mol (m2/mol), tetapi dalam praktiknya biasa digunakan L.mol-1.cm-1. 

Jadi, kenapa adanya kandungan Bromida harus dilakukan pengukuran serapan jenis? Padahal diketahui bahwa serapan yang muncul adalah dari senyawa organiknya yaitu Piridostigmin, bukan dari Bromidanya. Lalu kenapa? Karena jika dibandingkan dengan Klorida, dengan adanya kandungan Bromida, bobot molekulnya jauh sekali berbeda. Jadi sumbangan bobot molekul Bromida terhadap bobot molekul total besar sekali dibandingkan dengan Klorida. Jadi kesalahan akan perbandingannya sangat menentukan serapan jenisnya. Antara Piridostigmin dengan Bromida adalah 1:1, kalau terjadi penyimpangan menjadi 1:2 maka akan sangat berpengaruh terhadap serapan jenisnya. 

Secara garis besar, uji cemaran umum itu prosedurnya sama untuk tiap sampel, hanya saja yang berbeda adalah sistem kromatografinya, terkait dengan pelarut dan fase geraknya. Penampak bercak juga berbeda. Meskipun demikian, harus dilakukan konfirmasi, apakah fase gerak ini benar-benar bisa memisahkan antara uji dengan bercak cemaran. Karena tidak mungkin suatu sampel tidak ada cemarannya sama sekali, jadi harus ada bercak yang terpisah. Jika tidak ada yang terpisah, artinya ada yan salah dari sistem kromatografinya, atau pengerjaannya yang salah. Lakukan lagi berulang-ulang sampai diperoleh ada yang terpisah. 

Untuk menentukan besarnya persentase cemaran, dapat dibandingkan dengan intensitas bercak Larutan baku. Berdasarkan metode yang telah disebutkan di atas untuk Piridostigmin Bromida, larutan baku dibuat dengan kadar  0,01; 0,05; 0,1 dan 0,2 mg per ml, dikonversi ke persen, berapa persen kadar-kadar itu terhadap larutan sampel. Larutan sampel yang dibuat adalah 10 mg/ml. Artinya untuk kadar 0,01 mg/ml dibagi 10 mg/ml dikali 100%, sama dengan 0,1%. Jadi urutan persentase larutan kadarnya antara lain 0,1%, 0,5%, 1%, dan 2%. 

Misalnya hasil elusi ditunjukkan penampakkan bercak pada gambar di atas. Terdapat dua bercak dengan ukuran yang sama dengan kadar larutan baku 0,1%, maka jumlah persentase dua bercak lain selain bercak utama adalah 0,1% + 0,1% sama dengan 0,2%. Maka, memenuhi persyaratan uji cemaran umum, yaitu jumlah cemaran umum tidak lebih dari 2,0%. 

Penentuan jumlah persentase cemaran tidak mengharuskan harus memiliki KLT-densitometri, jadi dengan pengamatan saja, membandingkan intensitas bercak lain pada sampel terhadap bercak standar sudah cukup. 

Sekian untuk pembahasan tugas pertama yang disampaikan oleh kelompok 1. Terima kasih kepada teman-teman atas kerja kerasnya mengerjakan tugas dengan baik yaitu Mayang, Kikay, Acid, Ismi, dan Angelina. Mohon maaf apabila terdapat kesalahan. Semoga bermanfaat dan terima kasih sudah berkunjung :D